肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体以及gDNA尺度物资的研制（二）-前合后仰网

1.3措施

1.3.1DNA提取

接管天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，肠道肠埃尺度详细措施以及步骤参照试剂盒剖析书。集聚菌菌所提取的性大希氏菌株DNA运用核酸卵白合成仪以及Qubit荧光定量测定仪检测基因组DNA的纯度以及浓度，并送北京诺禾致源科技股份有限公司妨碍全基因组测序。体及

1.3.2细菌全基因组测序及生物信息学合成

经电泳检测及格的物资DNA样品用超声波破碎仪随机打断妨碍度约为350bp的片断，经收尾修复、肠道肠埃尺度加A尾、集聚菌菌加测序讨论、性大希氏纯化、体及PCR扩增等步骤实现文库制备。物资运用Qubit2.0以及Agilent2100对于构建好的肠道肠埃尺度文库妨碍开始定量以及插入片断检测。插入片断适宜预期后，集聚菌菌运用Q-PCR对于文库的性大希氏实用浓度妨碍准判断量。文库检测及格后接管北京诺禾致源科技股份有限公司的体及IlluminaNovaSeq6000测序零星妨碍全基因组测序。对于illumina测序平台的物资数据妨碍低品质过滤，搜罗去除了实用信号、去除了测序讨论以及锚定引物序列、去除了重大序列以及一再序列，从而取患上高品质的实用数据（CleanData）妨碍后续合成。运用SOAPdenovo软件妨碍组装，用RAST对于组装序列妨碍诠释(http://rast.nmpdr.org)。运用基因组盛行病学中间（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默认阈值，对于组装序列妨碍判断（http://www.genomicepidemiology.org），运用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）对于基因组组成妨碍合成（https://www.patricbrc.org/），运用CGEVirulenceFinder在线数据库对于血清分型、MLST分型以及毒力基因妨碍合成。

1.3.3特色性基因PCR检测措施

将提取的CMCC44841基因组DNA定量后，分说妨碍10倍梯度稀释，患上到10-一、10-二、10-三、10-4系列浓度，参照GB4789.6-2016中引物序列以及PCR检测措施，妨碍astA、aggR、pic特色性基因PCR扩增以及锐敏度检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.4尺度物资的破费制备

1.3.4.1EAEC菌体尺度物资的制备

取CMCC44841一代别致哺育物，划线接种于TSA平板，36℃哺育24h。用无菌棉签从平板上刮取菌落，退出到含有海藻糖以及胎牛血清的冻干呵护剂中，涡旋混匀，用移液枪罗致20μL在高温下速冻成球，而后于冷冻干燥机中冷冻干燥。将冻干后的菌球置于2mL的西林瓶中，运用冷冻干燥机妨碍真空压盖密封。最终制备成EAEC含量为103CFU/样品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA尺度物资的制备

将纯度A260/A280为1.7的20µgDNA退出到20ml含有葡聚糖的冻干呵护剂中，用移液枪罗致20μL在高温下速冻成球，而后于冷冻干燥机中妨碍冷冻干燥，最终制备成含量为20ng/样品的菌球。将冻干后的菌球放入2mL的西林瓶中，将胶塞虚掩的盖在西林瓶上，而后用冷冻干燥机妨碍真空压盖。

1.3.5尺度物资平均性测试

1.3.5.1EAEC菌体尺度物资平均性测试

凭证尺度物资平均性钻研抽取样品数目要求，从制备的一批600瓶尺度物资中随机抽取20瓶样品，每一瓶样品短缺溶于1mL心理盐水，运用螺旋涂布仪E50方式在TSA平板上妨碍螺旋涂布，每一个样品2个平行。36℃哺育24h后对于平板妨碍菌落计数。凭证CNAS-GL003对于计数服从妨碍单因子方差合成，评估样品的平均性。

1.3.5.2EAECgDNA尺度物资平均性测试

凭证尺度物资平均性钻研抽取样品数目要求，从制备的一批300瓶尺度物资中随机抽取10件样品，向每一瓶尺度物资样品退出100μLddH2O，短缺消融，制备成20ng/100μL浓度的DNA样品，取2μL作为模板，参照GB4789.6-2016中引物序列以及PCR检测措施，妨碍astA、aggR、pic特色性基因PCR扩增。

1.3.6尺度物资晃动性测试

1.3.6.1运输晃动性

将制备的EAEC菌体尺度物资以及gDNA尺度物资分说寄存于25℃以及37℃条件下，EAEC菌体尺度物资模拟试验周期为7天，分说于一、三、五、7天抽取3个样品，妨碍含菌量测定。凭证CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ原则对于服从妨碍晃动性评估。EAECgDNA尺度物资模拟试验周期为14天，分说于一、三、五、七、14天抽取3个样品，对于特色性基因妨碍PCR扩增，审核样品的运输晃动性。

1.3.6.2蕴藏晃动性

将制备的EAEC菌体尺度物资及gDNA尺度物资分说于-20℃、4℃条件下保存2个月。于4℃保存七、14以及28天，-20℃保存28以及60天，分说抽取3个样品妨碍菌含量测定，于4℃以及-20℃保存2八、45以及60先天辩抽取3个样品妨碍特色性基因检测，审核样品的蕴藏晃动性。凭证CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ原则对于EAEC尺度物资妨碍晃动性评估。

1.3.7尺度物资的相助验证

运用上述制备好的样品，凭证国家药品尺度物资相助标定实施细则，发给3家试验室，代码分说为A、B以及C，每一家试验室收到10件样品，参照像助验证作业教育书对于样品中EAEC尺度物资及其gDNA尺度物资妨碍魔难，搜罗菌落计数以及特色性基因检测。

1.3.8尺度物资运用下场验证

凭证GB29921-2013《食物清静国家尺度食物中致病菌限量》，抉择熟肉废品、乳粉、腐乳、饼干以及薯片5种食物基质共20份样品对于EAEC尺度物资的运用下场妨碍验证，样品信息见表1。先将EAEC103CFU浓度的尺度物资溶于1mL心理盐水中，每一件样品各称取2份，25g/份，一份个别魔难，一份退出尺度物资100μL，凭证GB4789.6-2016妨碍操作。增菌后划线分说平板审核是否有典型菌落妨碍，并妨碍PCR确认。