单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评估（二）-前合后仰网

1.4法兰克福香肠家养传染单核细胞增生李斯特菌

取同批号待检法兰克福香肠6～7袋，单核搓揉外包装，细胞性单使内容物与液体短缺打仗。增生珠的制备无菌开启包装，李斯链抗取浸出液40mL（每一袋约6mL），特菌特异体磁混匀，评估作为待测样，单核置4℃保存。细胞性单家养传染前，增生珠的制备取1mL浸出液经由增菌哺育法检测待测样。李斯链抗抉择未受李斯特菌属传染的特菌特异体磁待测样，接种别致哺育的评估单核细胞增生李斯特菌（AＴCC19115），使其终浓度约为＜1CFU/mL、单核1CFU/mL、细胞性单10CFU/mL以及100CFU/mL。增生珠的制备传染后将样品置4℃晃动24h，模拟食用前的微生物存活形态。

1.5法兰克福香肠家养传染单核细胞增生李斯特菌以及英诺克李斯特菌

取40mL待测样，分说接种别致哺育的单核细胞增生李斯特菌AＴCC19115（LM）以及英诺克李斯特菌AＴCC51742（LI）。菌液终浓度LM/LI的比例分说为1/1，1/10，1/100，1/1000，10/10，10/100，10/1000，100/10，100/100以及100/1000。传染后将样品置4℃晃动24h。

1.6目的菌的磁珠捉拿与菌落计数

1.6.1 BHI哺育基中磁珠的捉拿功能

分说将3株单核细胞增生李斯特菌以及6株此外李斯特菌属细菌接种至BHI哺育基中哺育（表3），制成约105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL，分说退出20μL免疫磁珠溶液，4℃细小振荡1h。用PBS缓冲液在磁力架上洗涤3次，用1mL相同的缓冲液重悬，需要时妨碍10倍系列稀释。以6×6滴板计数法（每一滴10μL）在BHI琼脂哺育基上计数，比力磁珠捉拿先后微生物的数目变更。

1.6.2法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测

以USDA-FSIS检测措施为根基（MicrobiologyLaboratoryGuidebook，MLG8.1），散漫磁珠捉拿以及PCR确认技术，检测法兰克福香肠中的单核细胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UＶM哺育基（Modifieduniversityofvermontbroth）90mL，退出10mL家养传染浸出液，置（30±2）℃振荡160r/min哺育（22±2）h。分说取0.1mLUＶM哺育物至第2次增菌的10mLFB哺育基（Fraserbroth）以及10mLMOPS-BLEB哺育基（Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth）中，置（35±2）℃振荡250r/min哺育（26±2）h。取上述UＶM、FB以及MOPS-BLEB哺育物各1mL，分说退出scFv-IMBs以及Dyna-IMBs溶液20μL，按1.6.1节的措施分说在BHI琼脂以及显色琼脂上计数。残余的磁珠捉拿液用于显色哺育基划线以及细菌基因组DNA提取。

2服从

2.1BHl哺育基中磁珠的捉拿功能

接管9株细菌审核BHI哺育基中两种磁珠的特异性。scFv-IMBs对于3株单核细胞增生李斯特菌的捉拿率在15%～55%之间，高于同种哺育基中Dyna-IMBs的0.85%～1.27%捉拿率。scFvIMBs除了对于斯氏李斯特菌以及伊氏李斯特菌的捉拿率略高于Dyna-IMBs外，对于李斯特菌属中非单核细胞增生李斯特菌的捉拿率均低于0.61%。在BHI纯哺育零星中，scFv-IMBs展现出精采的特异性以及较高的捉拿率。

2.2备选PCR引物的验证

为了从5种备选的引物中抉择出单核细胞增生李斯特菌特异性PCR检测引物，针对于23株待测微生物妨碍PCR引物验证。引物Lmo0733具备李斯特菌属水平特异性；格式李斯特菌干扰引物Aznar的检测；威尔斯李斯特菌、格式李斯特菌以及部份英诺克李斯特菌干扰引物Ｊaton的检测。经试验确认的单核细胞增生李斯特菌种水平的特异性为引物Fluit以及Nied（表1），这两对于引物目的靶点是对于李斯特菌溶血素O基因（hlyA）。由于引物Nied在51℃退火时具备较高的检测锐敏度，可检测到约2.86pg的单核细胞增生李斯特菌基因组（数据未列出），被用于后续试验的PCR检测中。

2.3法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测

在BHI以及显色哺育基上计数的菌落数（或者典型菌落数）分说代表了样品经UＶM、FB或者MOPS-BLEB哺育基哺育后，所有微生物的总数以及单核细胞增生李斯特菌的数目。法兰克福香肠浸出液经增菌哺育后，布景菌的浓度可抵达10⁷～10⁸CFU/mL，而单核细胞增生李斯特菌的浓度约为10²～10⁴CFU/mL，布景菌在哺育物中占有主导位置（表4）。由于高浓度布景微生物影响磁珠与目的微生物的散漫，导致在第一步UＶM哺育基中两种磁珠的捉拿率均低于5%，致使无奈在琼脂平板上分说取患上目的菌。经FB以及MOPS-BLEB哺育基二次增菌后，单核细胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前缺少0.01%（浓度小于10⁴CFU/mL）快捷提升到20%～80%（浓度约为10⁶～10⁸CFU/mL），而布景菌的数目未见清晰削减（表4）。其中，经MOPS-BLEB哺育后李斯特菌属细菌的终浓度会高于FB哺育基，并成为系统内优势菌，具备较好的抉择哺育性。